雞心乳酸脫氫酶（L-LDH）

一、產(chǎn)品介紹

二、乳酸底物法測定酶活

2.1 測定原理

在強堿性條件下，雞心L-LDH催化L-乳酸與NAD⁺反應生成丙酮酸和NADH。在一定范圍內NADH的生成速率與L-LDH活力成正比。在340nm處測定NADH的生成速率，根據酶活計算公式即可測出酶活力。1個(gè)酶活單位（U）等于在下述反應條件下每分鐘生成1微摩爾NADH所需的酶量。

2.2   檢測方法

1.     酶稀釋液：50mM PB-K，1mg/ml BSA，0.1% NaN3，pH7.0。過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期1年。

2.     Buffer：350mM CAPS（Mr=221.32），0.1% NaN3，pH10.0 (25℃)，過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期一個(gè)月。

3.     R1：1M 乳酸鋰，0.1% NaN3。過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期一個(gè)月。

4.     R2：9mM NAD ，0.1% NaN3。過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期為一周。

1.     R：臨用前按Buffer : R1 : R2=920ul : 80ul : 200ul比例混合，2-8℃保存，保質(zhì)期1天。用前恢復室溫。

2.     待測酶液S：稱(chēng)量所需的酶粉，用去離子水或50mM PB-K (pH 7.0)復溶，定容到既定體積配制成待測酶液S。用酶稀釋液將其稀釋至200-2000U/L內的2-5個(gè)梯度。

3.     酶活檢測步驟

1）   將1200ul的R添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中，37℃溫育1min；然后加入20ul待測酶液 S，充分混勻后，37℃反應至3min；記錄第2-3min內OD₃₄₀的變化，并計算每分鐘吸光值變化率（△As/min）。測活歷程如下：

2）   重復以上步驟，用20μl酶稀釋液作為陰性對照。記錄空白吸光值（△Ab/min）。

1.     計算公式

2.3 酶性質(zhì)附圖（乳酸底物法）

三、丙酮酸底物法測定酶活                

3.1  測定原理

在中性偏堿條件下，雞心L-LDH催化丙酮酸和NADH反應生成L-乳酸與NAD⁺。在一定范圍內NADH的消耗速率與L-LDH活力成正比。在340nm處測定NADH的消耗速率，根據酶活計算公式即可測出酶活力。1個(gè)酶活單位（U）等于在下述反應條件下每分鐘消耗1微摩爾 NADH所需的酶量。

3.1  檢測方法

1.     Buffer：100mM PB-K，pH7.0。

2.     酶稀釋液：50mM PB-K，1mg/ml BSA，0.1%NaN3，pH7.0。過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期1年。

3.     R1：100mM PB-K，25.4mM丙酮酸鈉鹽或鉀鹽，0.1%NaN3，pH7.0。過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期一個(gè)月。

4.     R2：10mM Tris-HCl， 10mg/ml NADH，0.1%NaN3，pH9.7，過(guò)0.22um濾膜后2-8℃保存，保質(zhì)期1周。

5.     R：臨用前按Buffer : R1 : R2=3000ul : 100ul : 50ul比例混合，2-8℃保存，保質(zhì)期1天。用前恢復室溫當OD₃₄₀<0.8時(shí)，重新配置R。若OD₃₄₀依然小于0.8，請重新配置R2。

6.     待測酶液S：稱(chēng)量所需的酶粉，用去離子水或50mM PB-K (pH 7.0)復溶，定容到既定體積配制成待測酶液S。用酶稀釋液將其稀釋至500-3000U/L范圍內的2-5個(gè)梯度。

7.     酶活檢測步驟

1）   將1200ul的R添加至“d=1.0cm”的石英比色皿中，37℃溫育1min；然后加入20ul待測酶液 S，充分混勻后，37℃反應至3min；記錄第2-3min內OD₃₄₀的變化，并計算每分鐘吸光值變化率（△As/min）。測活歷程如下：

2）   重復以上步驟，用20μl酶稀釋液作為陰性對照。記錄空白吸光值（△Ab/min）。

8.     計算公式

3.3 酶性質(zhì)附圖（丙酮酸底物法）